Анализы пцр что это такое

Анализы пцр что это такое

Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию. Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.

ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Сферы применения метода

Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:

  • ВИЧ;
  • герпеса;
  • различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
  • кандидоза;
  • гепатитов;
  • мононуклеоза;
  • листериоза;
  • цитомегаловируса;
  • туберкулеза;
  • вируса папилломы человека;
  • клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.

Преимущества и недостатки подхода

У диагностики методом ПЦР много плюсов:

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.

Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.

Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.

Оперативность. Результат, как правило, готов через 5–7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.

Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.

Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Методы ПЦР-диагностики заболеваний

Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.

Расшифровка результатов

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

В современном мире существует множество способов обнаружить возбудителей заболеваний на разных этапах развития заболевания. Одним из таких методов является PCR (метод ПЦР или полимеразная цепная реакция), позволяющий выявить инфекцию на самом раннем этапе. Буквально одна единица ДНК или РНК уже могут указать на наличие того или иного возбудителя в организме при должном уровне подготовки пациента и профессионализма лаборантов медицинского учреждения.

ПРЦ-исследование, что это такое?

Анализ на ПЦР заключается в копировании ДНК и РНК возбудителя в лабораторных условиях. Так как основным хранилищем генетической информации является ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), образованная 2 нитями, соединенными нуклеотидами, именно при множественном копировании (синтезе) этой кислоты можно установить наличие патогенного организма, если речь идет о бактерии.

Бактерии имеют свою собственную оболочку, защищающую их от внешней среды, которая нередко является агрессивной по отношению к последним. У вирусов же нет собственной оболочки (у некоторых представителей имеется нечто похожее на оболочку), а информацию в себе несет не ДНК, а РНК (рибонуклеиновые кислоты).

РНК устроены таким образом, что они встраиваются в цепи ДНК организма-переносчика и меняют их, позволяя проникать в клетки и жить за счет организма. Грубо говоря, бактерии и вирусы оставляют «отпечатки» своими ДНК и РНК, которые и выявляет анализ ПЦР. Эти «отпечатки», как и отпечатки пальцев, являются уникальными для каждого возбудителя. Поэтому ПЦР позволяет выявить заболевание на любых этапах, даже если развитие патогена происходит бессимптомно.

До широкого внедрения ПЦР в гинекологии и урологии на ИППП широко использовались методы:

  • микроскопия — окрашенные и неокрашенные препараты исследуются через микроскоп. Метод очень завязан на опытности лаборанта. Таким методом хорошо выявляются бактерии, имеющие большой размер (гарднереллы, кандиды,трихомонады,гонококки);
  • бактериология — метод заключается в выращивании возбудителей инфекции на питательном агаре, идентификации возбудителя и определения чувствительности его к антибиотикам. Долгое время считался «золотым стандартом». К минусам относят необходимость быстрой доставке материала в КДЛ (клинико-диагностическая лаборатория), сроки выращивания и выяснения чувствительности к группам антибактериальных препаратов (как правило, 5-7 суток);
  • иммуноферментный анализ — Определение антител организма, возникающих в ответ на внедрение антигена возбудителем инфекции. Из плюсов стоит отметить возможность определения стадии заболевания (острая стадия сопровождается наличием IgG в сыворотке крови, хроническая – IgM.) К минусам относится невозможность определения у людей с ослабленным иммунитетом, а также специфичность ИФА. Другими словами, при наличии только результата иммуноферментного анализа, невозможно было выставить диагноз, а можно было только определить, что организм борется с какой-либо инфекцией.
Читайте также:  Клебсиелла пневмония что это такое

Как происходит сдача анализов на ПЦР

В зависимости от материала, который забирается для проведения анализа ПЦР, существует несколько обязательных правил для пациента. Кровь сдается строго натощак утром. Мочу тоже стоит сдавать утром, первую порцию. Мокрота также сдается натощак, хотя это и необязательно. Мазки сдаются в любое время суток и имеют специфические требования. Мазок из ротоглотки также следует сдавать утром до приема пищи.

Забор материала производится сертифицированным специалистом стерильными одноразовыми инструментами. Берут анализ крови на ПЦР одноразовым стерильным шприцом, из вены забирают приблизительно 1-2 мл венозной крови для выявления таких инфекций как герпес или ВПЧ (вирус папилломы человека). Мочи достаточно 10 мл, мокроты – субстанции, размером со спичечную головку.

Для каждого вида анализа ПЦР существуют свои требования:

  • кровь, как говорилось выше, забирают из вены натощак;
  • мочу следует сдавать утром, первую порцию. Но, если забор является срочным, то достаточно сдать мочу по прошествии 2 часов после последнего мочеиспускания. Это позволит инфекции набрать необходимую критическую массу на 1 мл для более простого обнаружения патогена;
  • как берут соскоб из уретры. Первым делом обрабатывают раствором NaCl 0.9% наружное отверстие уретры. Затем, совершая циркулярные движения, зонд проводят на 2-4 см в уретру. Головку зонда, которая имеет щетинистое строение отсекают и кладут в пробирку со специальным раствором (своеобразный питательный агар для бактерий);
  • из влагалища производят мазок. Предварительно убирают секрет бартолиновых желез, затем из заднего нижнего свода влагалища специальной ватной палочкой происходит забор материала. При видимых патологических изменениях во влагалище мазок следует брать непосредственно на поврежденном участке;
  • как проводят соскоб из цервикального канала у женщин. Удалив слизь из наружных половых путей, зонд на 0,5 – 1,5 см вводят в шейку матки, совершают циркулярное движение и, не касаясь стенок влагалища, удаляют зонд из половых путей. Затем совершают действия, аналогичные соскобу из уретры;
  • из ротоглотки забор происходит натощак. Придерживая кончик языка, зондом производят мазок с задней стенки глотки, по миндалинам или по небным дужкам. Не соприкасаясь со слизистой ротовой полости и зубами, зонд выводится и отправляется на пцр-исследование;
  • из конъюнктивы, предварительно очистив физиологическим раствором гнойные выделения, производят соскоб слизистой нижнего века от латерального к медиальному краю. Веко при этом придерживается медицинским работником во избежание соприкосновения зонда со слизистой глаза и ресницами.

Подготовка к исследованию

Анализ на ПЦР является самым быстрым и достоверным способом на ранних этапах обнаружить инфекцию, но бывают и ложноположительные/ложноотрицательные результаты.

Для сохранения нервной системы как своей, так и сотрудников медицинского учреждения, следует правильно подготовиться к исследованию.

Подготовка к ПЦР у мужчин

Перед исследованием ПЦР мужчинам следует помнить, чего делать нельзя:

  • мочиться за 3 часа до исследования;
  • производить спринцевание и стерильную обработку члена;
  • мыть член мылом, содержащим антибиотик;
  • заниматься сексом за двое суток до ПЦР на ИППП;

Подготовка к ПЦР в гинекологии

Женщинам перед тем как сдать мазок на ПЦР запрещено:

  • при соскобе из уретры запрещено мочиться за 3 часа до исследования;
  • использовать вагинальные растворы с дезинфицирующими свойствами;
  • за двое суток до исследования применять суппозитории для влагалища;
  • использовать антибиотики местно, в том числе и мыло с антибиотиком;
  • занятия сексом за 48 часов до исследования;
  • применять антибиотик внутрь влагалища и уретры;
  • спринцеваться;
  • принимать антибиотики. После последнего приема антибактериального препарата должно пройти не менее 4 недель;
  • сдавать ПЦР во время менструации.

Общие сведения при исследовании мочи для мужчин и женщин

Следует сдать на анализ первую мочу утром, ее среднюю порцию. Другими словами начинать мочиться следует в унитаз. Затем остановить акт мочеиспускания, подставить под уретру баночку для сбора мочи, продолжить мочиться в течении 2-3 секунд, затем снова остановить мочеиспускание и, убрав контейнер, закончить акт мочеиспускания в унитаз.

Женщинам и мужчинам перед тем как сдать ПЦР следует хорошо вымыть наружные половые органы для исключения попадания в мочу смегмы (смесь секрета сальных желез крайней плоти) и выделений из влагалища.

Баночка для мочи должна быть стерильной. Попросите контейнер в клинике, где вы сдаете анализ, либо заранее приготовьте баночку с плотно закрывающейся крышкой и прокипятите их не менее 10 минут.

Непосредственно перед сдачей ПЦР запрещено:

  • мочиться (необходима самая первая порция мочи за день);
  • изменять количество выпитой за сутки до исследования жидкости. Это необходимо, чтобы поддерживать обычный водно-электролитный баланс организма, в котором себя комфортно чувствует потенциальный возбудитель инфекции;
  • использовать уросептики;
  • применять мыло, содержащее в себе антибиотик;
  • заниматься сексом за 12 часов до исследования;
  • при менструации желателен забор мочи уретральным катетером для исключения попадания крови в контейнер с мочой;

Если один из пунктов был нарушен:

Следует воздержаться от проведения диагностики инфекций методом ПЦР. Если же все-таки анализ был сдан, следует его повторить через двое суток. Если при использовании антисептиков и антибиотиков результат оказался «хорошим» – не стоит радоваться. Скорее всего, при наличии определенных жалоб, это ложноположительный результат.

Расшифровка результатов ПЦР

Расшифровка анализов ПЦР очень просто (см примерный бланк выше). Существует положительный и отрицательный результаты исследования. Положительный означает, что инфекция в организме есть, но это не должно наводить страх на пациента. Наоборот, это значит, что теперь можно начать лечение и вовремя остановить патоген. Отрицательный результат, соответственно, показывать отсутствие инфекции в организме.

Также не стоит забывать о ложноположительных/ложноотрицательных результатах. В медицине золотым стандартом является три одинаковых результата подряд в независимых клиниках. Стоит помнить, что в разных клиниках сама КДЛ (клинико-диагностическая лаборатория) может быть одна. То есть, здания и названия будут разные, но все анализы отправляются в одну лабораторию, связывающую эти клиники. Поэтому, получив результат в одной клинике, для того, чтобы удостовериться в правильности данного результата, стоит обратиться еще в две клиники и узнать, не сдают ли они результаты в одну и ту же КДЛ.

Широкий спектр исследований

Метод ПЦР относится к группе обширных анализов. С помощью ПЦР анализа можно определить практически любое заболевание. К сожалению, это не самый дешевый метод исследования, поэтому его не назначают всем пациентам поголовно. Цены могут варьироваться в зависимости от клиники и количества исследований.

Существует полимеразная цепная реакция (анализы ПЦР) на 12 инфекций. Какие инфекции входят в ПЦР 12:

  • микоплазмы гениталиум (mycoplasma genitalium) и гоминис (hominis);
  • трихомонады (trichomonas);
  • хламидии (chlamydia trachomatis);
  • уреаплазмы (ureaplasma, включающая ureaplasma parvum (уреаплазмы парвум));
  • кандиды (candida);
  • гарднереллы (gardnerella vaginalis);
  • гонококк (neisseria gonorrhoeae);
  • антитела IgG, IgM;
  • герпеса двух типов.

Также есть упрощенная ПЦР 6 диагностика. Она исключает уреаплазму парвум, кандиды, гонококк, IgG, IgM, герпес обоих типов.

ПЦР исследование на ВИЧ

ПЦР на ВИЧ следует выделить отдельным пунктом, так как тут существует специфический набор ограничений.

Читайте также:  Бепантен отзывы при дерматите

Во-первых, ПЦР на ВИЧ определяет не ДНК вируса иммунодефицита человека, а ДНК измененной вирусом клетки-лимфоцита. В нем будет храниться информация о вирусе и размножаться, создавая все больше пораженных лимфоцитов.

Сдавать анализ следует через 14 суток после известного контакта с ВИЧ-инфицированным человеком. Стоит помнить, что заразность этого вируса несколько преувеличена из-за тяжести нелеченного заболевания. Если произошел контакт через кровь, то тут шанс заразиться самый высокий, однако и он не превышает 85%. При остальных контактах вероятность заражения составляет от 1% до 10%.

При исследовании ПЦР на ВИЧ вероятность ложноположительного результата составляет около 2%, если не было нарушений среди медицинского персонала (правильно маркированная пробирка, не перепутали пробирки местами, не было загрязнения материала при вскрытии пробирки).

Длительность ПЦР может составлять от 4 часов до 7 суток, в зависимости от организованности медицинского учреждения, где происходит диагностика инфекций.

Плюсы и минусы ПЦР

При отражении плюсов ПЦР следует отметить:

  • чувствительность. Как говорилось выше, даже единичный агент, оставленный возбудителем, позволяет обнаружить инфекцию на ее ранней стадии или если она протекает скрытно;
  • широкий спектр. Например, ПЦР 6 позволяет 1 исследованием выявить целых 6 возбудителей;
  • точность. Ложные результаты при данном методе исследования имеют место быть, но их количество сведено к минимуму;
  • скорость. Как правило, пациент уже на следующий день может забрать готовый результат ПЦР исследования.
  • стоимость. ПЦР-исследование не включено в список исследований в системе ОМС. Дорогое высокоточное оборудование требует оплаты своей работы;
  • требования к соблюдению техники исследования и к профессионализму сотрудников;
  • требования к подготовке.

Видеозаписи по теме

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – наиболее информативный, точный и современный метод диагностики инфекционных заболеваний, позволяющий обнаружить возбудителя в организме пациента, даже если количество вредоносных клеток исчисляется единицами, и они пока не успели спровоцировать развитие болезни. Еще 25 лет назад врачи не могли даже мечтать о таких возможностях, а сегодня сдать анализ ПЦР можно в любой крупной лаборатории.

ПЦР-диагностика открыла перед людьми многие другие ценные перспективы – с помощью этой методики можно изучать генные мутации, устанавливать отцовство, вычислять риск развития онкологических заболеваний, оценивать возраст и происхождение археологических артефактов и даже доказывать вину преступников, обнаруживая их ДНК в уликах. Но сегодня мы обсудим именно медицинский аспект этого открытия и расскажем вам, какие заболевания можно диагностировать методом ПЦР, как сдавать анализ и что означают его результаты.

ПЦР — что это такое?

Любое живое существо на Земле, будь то человек, животное или микроб, имеет гены – носители наследственной информации, которые представляют собой участки ДНК или РНК с определенной последовательностью нуклеотидов, уникальной для каждого организма. ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота) образует длинные молекулы, состоящие из двух нитей, закрученных в спираль друг относительно друга, и эти нити собираются из нуклеотидов, как из бусинок.

Допустим, требуется увидеть, есть ли в биологическом материале пациента ДНК или РНК инфекционного возбудителя или ее фрагменты. Но как это сделать, если молекулы крошечные и их мало? Методика ПЦР дает ответ: можно искусственно размножить вредоносную ДНК или РНК в лабораторных условиях, чтобы без труда ее обнаружить и идентифицировать.

Суть полимеразной цепной реакции состоит в том, чтобы разъединить нити молекул и попытаться «подсадить» к их противоположным концам фрагменты ДНК или РНК возбудителей – если они подойдут, значит, это и есть искомый микроб. А добавленный в пробирку фермент под названием «ДНК-полимераза» запустит синтез новых копий нужных участков молекул, они многократно размножатся и станут заметны. Далее мы опишем простыми словами, как происходит этот удивительный процесс и для чего это необходимо.

Американский ученый Кэрри Муллис изобрел ПЦР в 1983 году, а спустя десять лет, в 1993 году, получил за свое открытие Нобелевскую премию по химии. Однако методика была несовершенной и требовала существенных доработок. На сегодняшний день существует уже более десятка видов ПЦР для разных диагностических целей.

Суть полимеразной цепной реакции

Итак, мы знаем, что длинная молекула ДНК или РНК образована двумя цепочками нуклеотидов, всего их бывает пять типов:

Ген – это устойчивая, многократно повторяемая уникальная комбинация нуклеотидов, и в одном гене их может быть несколько десятков или даже сотен, но все они располагаются друг напротив друга в строгом соответствии с правилом комплементарности. Это означает, что напротив гуанина в одной нити может стоять только цитозин из другой нити, а напротив аденозина – только тимин, иначе молекула ДНК не сложится и не закрутится в спираль. При этом пары «А – Т», «Т – А», «Г – Ц» и «Ц – Г» могут сочетаться в любых комбинациях: повторяться несколько раз подряд или идти вразнобой.

Схематически это можно представить так:

А – Т и так далее

У РНК вместо тимина есть урацил, и такие молекулы выступают носителями генетической информации у некоторых вирусов, называемых ретровирусами. Например, у вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

Вот это свойство – комплементарность – является ключевым для ПЦР-диагностики. Ведь чтобы началась амплификация (синтез дополнительных копий участков ДНК на родительской матрице), нужно чтобы «подсаженный» фрагмент ей подходил. Такой фрагмент называется праймером или попросту «затравкой» и содержит до тридцати нуклеотидов, расположенных в уникальной для каждого возбудителя последовательности. Праймеры для проведения ПЦР-анализов производятся отдельно и доставляются в лабораторию в готовом виде. На сегодняшний день в распоряжении врачей есть праймеры сотен различных бактерий, вирусов и простейших.

Чтобы процесс начался, необходимо соблюсти ряд условий: добавить нужные реагенты и создать особый температурный режим. Все это происходит в приборе под названием «амплификатор» или «термоциклер», который может обеспечить нагревание и охлаждение пробирок с точностью до 0,1°C. Современные модификации амплификаторов могут замораживать и хранить готовые материалы, а некоторые даже имеют встроенный флуоресцентный детектор для определения результатов анализа ПЦР в режиме реального времени, когда нужно вычислить вирусную нагрузку (об этом мы расскажем ниже).

Внутри амплификатора взятый у пациента биоматериал проходит несколько десятков циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурации, отжига и элонгации. Это самая интересная часть ПЦР-диагностики, давайте рассмотрим весь процесс в подробностях, а начнем с необходимых реагентов.

Компоненты полимеразной цепной реакции

Стандартный набор выглядит так:

Биоматериал, предположительно содержащий ДНК возбудителя заболевания;

Праймеры, то есть два комплекта нуклеотидов, комплементарных противоположным концам цепочек нужного фрагмента ДНК;

ДНК-полимераза – термостабильный фермент, который выступает катализатором реакции амплификации. К этому ферменту очень серьезные требования: он должен сохранять активность при высокой температуре длительное время – несколько часов, пока повторяются циклы ПЦР. Поэтому для проведения анализа используются ферменты, выделенные из термофильных микроорганизмов: Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза), Thermus thermophilus (Tth-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза) и другие;

Mg2+, то есть ионы магния, двухвалентного металла, необходимого ДНК-полимеразе для эффективной работы;

dATP, dGTP, dCTP и dTTP, четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата, из которых будут строиться новые фрагменты цепочек ДНК;

Буферный раствор, позволяющий поддерживать оптимальные условия – в него входят некоторые соли и сывороточный белок альбумин.

Читайте также:  Валидол в капсулах как принимать

Стадии полимеразной цепной реакции

Итак, реагенты помещены в пробирку, она установлена в амплификатор, что же происходит дальше? Запускается повторяющийся цикл из трех стадий, целью которых является амплификация ДНК инфекционных возбудителей, если таковые будут обнаружены в пробе.

Денатурация

Амплификатор нагревает пробирку до 94-98 °C и сохраняет такую температуру на протяжении 30 секунд – 2 минут, чтобы цепочки ДНК разошлись в стороны. Конкретное значение температуры и времени зависит от типа полимеразы и от того, какого именно микроба ищут. По-другому этот период называется стадией плавления. Большинство видов ПЦР-диагностики требуют прогрева пробирки перед первым циклом в течение 2-5 минут.

Отжиг

В игру вступают праймеры – один из них комплементарен первой нити развалившейся надвое цепочки ДНК, а другой подходит ко второй нити, причем, праймеры ограничивают начало и конец того участка молекулы, который необходимо достроить. Праймеры называют «затравкой», потому что фермент полимераза катализирует производство новых копий нужного фрагмента ДНК именно после соединения праймеров с родительской матрицей.

Чтобы это соединения произошло, амплификатор должен понизить температуру пробирки. Как правило, отжиг с праймерами производится при температуре на 5 °C ниже, чем нужно для их денатурации. Если установить слишком высокую температуру, праймеры будут плохо соединяться с матрицей, а если слишком низкую, они могут прикрепиться не в том месте, где нужно. Поэтому лучше показывают себя праймеры с температурой плавления выше 60 °C, ведь они позволяют проводить отжиг и элонгацию одновременно при 60-75 °C. Стадия отжига длится 30 секунд, и за этот короткий период полимераза уже успевает катализировать синтез двух-трех сотен новых нуклеотидов.

Элонгация

Происходит собственно амплификация, то есть размножение нужного участка вредоносной ДНК, если таковая обнаружена. В рамках одного цикла количество участков увеличивается вдвое, каждый последующий цикл опять приводит к двукратному увеличению их числа, то есть действует принцип геометрической прогрессии. А всего за время ПЦР-анализа проводится 30-50 циклов, что по времени занимает 2-3 часа.

Температура элонгации и длительность этой стадии зависит от того, какая полимераза используется и какова длина размножаемого участка ДНК. Например, для Taq и Pfu-полимеразы оптимальна температура 72 °C, при этом фермент произведет 1000 пар оснований за 1 минуту. По окончанию всех циклов ПЦР, как правило, запускают дополнительную, финальную стадию элонгации – она длится около 10 минут и позволяет достроить все оставшиеся участки ДНК.

Оценка результатов

Существует два способа определения итогов ПЦР-анализа: традиционный – электрофорез, когда в реакции задействуются обычные праймеры, а оценку результатов проводит человек, и более современный – сканирование в режиме реального времени, когда «затравки» меченые, а их свечение регистрирует прибор.

В первом случае все цепочки ДНК сортируются по размерам. У этого способа есть существенные недостатки: во-первых, лаборанту приходится открывать пробирки с материалом, следовательно, в них могут попасть посторонние фрагменты ДНК из соседних пробирок (контаминация ампликонами), и тогда результат анализа ПЦР будет ложноположительным. Во-вторых, оценку производит человек, что называется, «на глаз», поэтому достоверность полученных данных целиком зависит от внимательности и профессионализма специалиста.

В случае с ПЦР-диагностикой в режиме реального времени (Real-Time PCR) влияние человеческого фактора на итоги исследования минимально – пробирки помещаются в современный высокотехнологичный прибор и ни разу не открываются на протяжении всех циклов, включая анализ результатов, который тоже проводит умная машина. У этого способа только два очевидных недостатка – высокая стоимость и ограниченная доступность, поскольку амплификаторами нового поколения оснащена далеко не каждая лаборатория.

Для чего применяется ПЦР?

ПЦР-диагностика активно используется во многих отраслях клинической медицины:

Урогинекология и дерматовенерология. Это, пожалуй, самые заинтересованные в ПЦР врачебные направления. С помощью соответствующего анализа можно диагностировать любые заболевания, передающиеся половым путем: гонорею, трихомониаз, микоплазмоз, уреаплазмоз, хламидиоз, гарднереллез и т. д. Метод ПЦР позволяет обнаружить и вирусы, часто поражающие органы половой сферы человека – например, генитальный герпес или папилломовирус. А эти возбудители, как известно, обладают онкогенной активностью, то есть могут провоцировать развитие злокачественных опухолей (рака шейки матки у женщин, рака предстательной железы у мужчин);

Инфектология и эпидемиология. На втором (а возможно и на первом) месте по частоте использования ПЦР-диагностики находится инфекционная медицина, поскольку обсуждаемая методика позволяет диагностировать все распространенные заразные болезни, некоторые из которых несут смертельную угрозу здоровью людей и представляют эпидемиологическую опасность. Речь идет о ВИЧ, гепатитах, сифилисе, холере, бруцеллезе, токсоплазмозе, дифтерии, туляремии и прочих серьезных заболеваниях;

Донорство и трансплантология. ПЦР-диагностика позволяет службе крови оценивать качество донорского материала: выявлять опасных возбудителей и отсортировывать непригодный материал. А при пересадке органов очень важно оценить совместимость тканей донора и реципиента – тут на помощь тоже приходит методика ПЦР;

Генетика и репродуктология. С помощью специальных разновидностей ПЦР-анализа можно установить отцовство, просчитать риск возникновения опасных генных мутаций у предполагаемого потомства пары, обратившейся в центр планирования семьи, а также изучить взятый у беременной женщины биоматериал (например, амниотическую жидкость) с той же целью – вовремя обнаружить тяжелый порок развития плода;

Акушерство и неонатология. Современные родильные дома тоже часто используют ПЦР-диагностику, а некоторые даже имеют собственную лабораторию. Это нужно для того, чтобы максимально оперативно обследовать новорожденных малышей при подозрении на наличие у них внутриутробной или полученной во время родов инфекции: ВИЧ, сифилиса, хламидиоза, цитомегаловируса, мононуклеоза, краснухи и других;

Пульмонология и фтизиатрия. Метод ПЦР дает возможность специалистам этих врачебных направлений бороться с редкими, устойчивыми штаммами бактерий, вызывающих респираторные заболевания, например, атипичный хронический бронхит. В этом случае успех лечения целиком зависит от того, удастся ли точно идентифицировать возбудителя болезни и назначить адресную терапию. Кроме того, ПЦР-анализ позволяет проводить максимально раннюю диагностику туберкулеза;

Гастроэнтерология и аллергология. Врачи этих двух специальностей тоже крайне заинтересованы в методе ПЦР, поскольку он дает возможность обнаружить главную причину развития гастрита и язвы желудка – коварную бактерию Хеликобактер пилори, а также установить индивидуальную непереносимость продуктов питания у конкретного человека. Существуют врожденные особенности работы пищеварительного тракта, не позволяющие правильно перерабатывать и усваивать некоторые компоненты пищи, например, глютен или лактозу. Эти особенности наследуются генетически, следовательно, могут быть обнаружены методом ПЦР. Кстати, если у кого-то из родителей есть аллергия на определенный продукт (орехи, грибы, цитрусовые), то велика вероятность того, что у ребенка возникнет такая же проблема;

Онкология. Специалисты этого серьезнейшего направления медицины используют ПЦР-диагностику для оценки риска развития злокачественных опухолей у пациента, поскольку те клетки человеческого тела, которые подвергаются мутации и начинают бесконтрольно делиться, меняют структуру своей ДНК и начинают отличаться от здоровых клеток. Необходимо взять пункцию или биопсию подозрительных тканей и изучить материал методом ПЦР, чтобы установить масштабы угрозы.

А вот лишь неполный список тех вредоносных микроорганизмов, которые можно обнаружить с помощью ПЦР-анализа:

Обширное семейство герпес-вирусов, в том числе цитомегаловирус, варицелла-зостер, вирус Эпштейна-Барра и другие;

Ссылка на основную публикацию
Алт печени норма у женщин
АЛТ (аланинаминотрансфераза) и АСТ (аспартатаминотрансфераза) – ферменты эндогенного типа, принимающие активное участие в обмене аминокислот. Выработка веществ осуществляется на внутриклеточном...
Adblock detector